Oxacillin disk diffusion testing for the prediction of penicillin resistance in Streptococcus pneumoniae / Prueba de difusión con discos de oxacilina para predecir la resistencia a la penicilina de Streptococcus pneumoniae

ABSTRACT Objective To 1) describe the correlation between the zones of inhibition in 1-µg oxacillin disk diffusion (ODD) tests and penicillin and ceftriaxone minimum inhibitory concentrations (MICs) of meningeal and non-meningeal strains of Streptococcus pneumoniae and 2) evaluate the usefulness of the ODD test as a predictor of susceptibility to penicillin in S. pneumoniae and as a quick and cost-effective method easily implemented in a routine clinical laboratory setting. Methods S. pneumoniae isolates from healthy nasopharyngeal carriers less than 2 years old, obtained in a multicentric cross-sectional study conducted in various Peruvian hospitals and health centers from 2007 to 2009, were analyzed. Using Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) breakpoints, the correlation between the zones of inhibition of the ODD test and the MICs of penicillin and ceftriaxone was determined. Results Of the 571 S. pneumoniae isolates, 314 (55%) showed resistance to penicillin (MIC ≥ 0.12 µg/mL) and 124 (21.7%) showed resistance to ceftriaxone (MIC ≥ 1 µg/mL). Comparison of the ODD test zones of inhibition and the penicillin MICs, using the CLSI meningeal breakpoints, showed good correlation (Cohen’s kappa coefficient = 0.8239). Conclusions There was good correlation between ODD zones of inhibition and penicillin meningeal breakpoints but weak correlation between the ODD results and non-meningeal breakpoints for both penicillin and ceftriaxone. Therefore, the ODD test appears to be a useful tool for predicting penicillin resistance in cases of meningeal strains of S. pneumoniae, particularly in low- and middle- income countries, where MIC determination is not routinely available.

RESUMEN Objetivo 1) Describir la correlación entre las zonas de inhibición observadas en la prueba de difusión con discos de oxacilina de 1 µg y la concentración inhibitoria mínima (CIM) de penicilina y ceftriaxona frente a cepas meníngeas y no meníngeas de Streptococcus pneumoniae y 2) evaluar si la prueba de difusión con discos de oxacilina permite predecir la sensibilidad de S. pneumoniae a la penicilina y sirve como método rápido y eficaz en función de los costos, y resulta fácil de aplicar en los laboratorios clínicos ordinarios. Métodos Se analizaron colonias de S. pneumoniae aisladas de la nasofaringe de portadores sanos menores de 2 años obtenidas en un estudio transversal multicéntrico realizado en diversos hospitales y centros de salud del Perú entre los años 2007 y 2009. Se determinó la correlación entre las zonas de inhibición observadas en la prueba de difusión con discos y la CIM de la penicilina y la ceftriaxona utilizando los valores críticos definidos por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. Resultados De las 571 colonias aisladas de S. pneumoniae, 314 (55 %) presentaron resistencia a la penicilina (CIM ≥ 0,12 µg/ml) y 124 (21,7%), resistencia a la ceftriaxona (CIM ≥ 1 µg/ml). Se observó una buena correlación (coeficiente κ de Cohen = 0,8239) entre las zonas de inhibición de la prueba de difusión con discos y la CIM de la penicilina utilizando los valores críticos del Instituto respecto de las cepas meníngeas. Conclusiones Se encontró una buena correlación entre las zonas de inhibición de la prueba de difusión con discos y los valores críticos de CIM de la penicilina respecto de las cepas meníngeas, pero una correlación débil entre los resultados de la prueba de difusión y los valores críticos tanto de la penicilina como de la ceftriaxona respecto de las cepas no meníngeas. Por consiguiente, la prueba de difusión con discos es un método de utilidad para predecir la resistencia a la penicilina de las cepas meníngeas de S. pneumoniae, en particular en los países de ingresos bajos y medianos, donde no suele ser posible determinar la CIM.

Resistencia antibiótica de streptococcus pneumoniae en portadores nasofaríngeos sanos de siete regiones del Perú / Antibiotic resistance of streptococcus pneumoniae among healthy nasopharyngeal carriers in seven regions of Peru

Objetivos. Determinar el patrón de susceptibilidad antibiótica de cepas de Streptococcus pneumoniae aisladas de portadores nasofaríngeos sanos menores de 2 años de siete regiones del Perú. Materiales y métodos. Entre el 2007 y 2009 se tomaron muestras de hisopado nasofaríngeo a 2123 niños sanos entre 2 y 24 meses de edad en los consultorios de crecimiento y desarrollo (CRED) y vacunación de hospitales y centros de salud de Lima, Piura, Cusco, Abancay, Arequipa, Huancayo, e Iquitos. Se determinó la resistencia a diez antibióticos mediante la prueba de disco-difusión de las cepas de neumococo aisladas. Resultados. Se aislaron 572 cepas. Se encontró altas tasas de resistencia a cotrimoxazol (58%); penicilina (52,2% no-sensibles); tetraciclina (29,1%); azitromicina (28,9%), y eritromicina (26,3%). La resistencia a cloranfenicol fue baja (8,8%). Se encontró 29,5% de multirresistencia. La resistencia a la azitromicina y a la penicilina fue diferente en las siete regiones (p<0,05), hallándose el mayor porcentaje de cepas no-sensibles a penicilina en Arequipa (63,6%), mientras que el menor fue en Cusco (23,4%). Conclusiones. Los elevados niveles de resistencia encontrados para penicilina, cotrimoxazol y macrólidos en cepas de neumococo aisladas de portadores sanos en todas las regiones estudiadas, y su asociación con uso previo de antibióticos, representan un importante problema de salud pública en nuestro país. Esto resalta la necesidad de implementar, a nivel nacional, estrategias para disminuir el uso irracional de antibióticos, sobre todo en la población pediátrica. Es necesario complementar los datos de resistencia a penicilina con la determinación de la concentración mínima inhibitoria para hacer las recomendaciones terapéuticas respectivas.

Objectives. To determine the pattern of antibiotic susceptibility of isolated Streptococcus pneumoniae strains of healthy nasopharyngeal carriers younger than 2 years in seven regions of Peru. Materials and methods. Between 2007 and 2009, nasopharyngeal swab samples were collected among 2123 healthy children aged 2-24 months in growth and development medical practices (CRED) and vaccination offices of hospitals and health centers in Lima, Piura, Cusco, Abancay, Arequipa, Huancayo, and Iquitos. The resistance to ten antibiotics through disk diffusion sensitivity testing of isolated pneumococcus strains was determined. Results. 572 strains were isolated. High rates of resistance to co-trimoxazole (58%), penicillin (52.2% non-sensitive); tetracycline (29,1%); azithromycin (28,9%), and erythromycin (26,3%). Resistance to chloramphenicol was low (8.8%). Multiresistance was found at 29.5%. Resistance to azithromycin and penicillin was different in all seven regions (p<0,05), the highest percentage of non-sensitive strains being found in Arequipa (63,6%), whereas the lowest percentage was found in Cusco (23.4%). Conclusions. High levels of resistance found to penicillin, co-trimoxasole and macrolides in isolated pneumococcus strains of healthy carriers in all studied regions, and their association to a previous use of antibiotics, represent a significant public health problem in our country. This emphasizes the need to implement nationwide strategies to reduce the irrational use of antibiotics, especially among children. It is necessary to complement data of resistance to penicillin with the determination of minimal inhibitory concentration to make proper therapeutic recommendations.

Serotipos de neumococo en niños portadores antes de la vacunación antineumocócica en el Perú / Pneumococcal serotypes in carrier children prior to the introduction of anti-pneumococcal vaccines in Peru

Objetivos. Determinar la frecuencia y distribución de serotipos de S. pneumoniae en portadores nasofaríngeos sanos menores de dos años previa al uso universal de la vacuna conjugada antineumocócica en el Perú. Materiales y métodos. Entre los años 2007 y 2009 se tomaron muestras de hisopado nasofaríngeo a 2123 niños sanos entre 2 y 24 meses de edad en los consultorios de crecimiento y desarrollo o vacunación de hospitales y centros de salud de siete ciudades del Perú: costa (Lima, Piura); sierra (Cusco, Abancay, Arequipa y Huancayo) y selva (Iquitos). Las cepas de neumococo fueron aisladas e identificadas en el laboratorio central del proyecto en Lima y serotipificadas por reacción de Quellung en el Laboratorio de Referencia de Neumococo del Centro de Control y Prevención de Enfermedades. Resultados. Se encontró 27,0% (573/2123) de portadores nasofaríngeos sanos de neumococo. En las 526 cepas analizadas se encontraron 42 serotipos; los más frecuentes fueron: 19F (18,1%), 6B (14,3%); 23F (8,9%) y 14 (6,5%). Conclusiones. La distribución de serotipos vacunales en las cepas analizadas fue de 50,0% para los serotipos presentes en la vacuna conjugada heptavalente; 50,2% para los serotipos presentes en la vacuna decavalente y 57,2% para la vacuna 13-valente.

Objectives. To determine the carriage rate and serotype distribution of Streptococcus pneumoniae in the nasopharynx of healthy children younger than 2 years prior to the universal use of the pneumococcal conjugate vaccines in Peru. Materials and methods. Between 2007 and 2009 we collected nasopharyngeal swab samples from 2,123 healthy children aged 2 to 24 months in the vaccination and healthy children consultation offices of pediatric hospitals and health centers in 7 cities in Peru: on the coast (Lima, Piura), highlands (Cusco, Abancay, Arequipa and Huancayo) and amazon basin (Iquitos). The pneumococcal strains were isolated and identified at the central laboratory of the project in Lima, and serotyped by Quellung reaction in the pneumococcal reference laboratory at the Center for Diseases Control and Prevention (CDC). Results. We found 27% (573/2123) of pneumococcal nasopharyngeal healthy carrier children. Among the 526 analyzed strains, we found 42 serotypes; the most common were: 19F (18.1%), 6B (14.3%); 23F (8.9%) and 14 (6.5%). Conclusions. The distribution of vaccine serotypes in the analyzed strains was of 50% for the serotypes present in the seven-valent vaccine, 50.2% for the serotypes present in the ten-valent vaccine and 57.2% for those present in the thirteen-valent vaccine.

Frecuencia y patotipos de Escherichia coli diarrogénicas en niños peruanos con y sin diarrea / Frequency and pathotypes of diarrheagenic Escherichia coli in peruvian children with and without diarrhea

Introducción. Las E. coli diarrogénicas (DEC) son una de las principales causas de diarrea en niños en países en vías de desarrollo. Sin embargo, no son rutinariamente diagnosticadas en los laboratorios clínicos. Objetivos. Determinar la prevalencia de las DEC en niños peruanos y describir la variabilidad genética de estas cepas. Materiales y métodos. Se utilizaron 8 003 cepas de E. coli previamente aisladas de ocho estudios previos de diarrea en niños, mayormente en zonas periurbanas de Lima. El diagnóstico de las DEC fue a través de un PCR múltiple a tiempo real para los seis grupos de DEC. Se empleó PCR para la determinación de genes adicionales de virulencia. Resultados. La prevalencia promedio global en muestras de diarrea (n=4 243) fue: E. coli enteroagregativa (EAEC) 9,9 por ciento, enteropatogénica (EPEC) 8,5 por ciento, enterotoxigénica (ETEC) 6,9 por ciento, difusamente adherente (DAEC) 4,8 por ciento, productora de toxina shiga (STEC) 0,8 por ciento y enteroinvasiva (EIEC) 0,6 por ciento. La frecuencia relativa de cada patógeno varía según la edad y tipo de estudio. Los principales patotipos en muestras control (n=3 760) fueron EPEC (10,9 por ciento) y EAEC (10,4 por ciento). Se encontró una gran variabilidad en la frecuencia de genes de virulencia para cada patotipo, así como en los mecanismos moleculares de resistencia, sin diferencias significativas entre muestras de diarrea y control. Conclusiones. Las DEC son causa importante de diarrea en niños peruanos. Estos patógenos son altamente heterogéneos. Se requieren estudios adicionales para determinar la prevalencia en zonas rurales del Perú, así como en casos graves de diarrea.

Introduction. Diarrheagenic E. coli (DEC) are a major cause of diarrhea in children in developing countries. However, they are not part of routine diagnosis in clinical laboratories. Objectives. To determine the DEC prevalence in Peruvian children and to describe the genetic variability of these strains. Materials and methods. A total of 8 003 E. coli strains previously isolated from eight different studies of diarrhea in children, mainly from peri-urban areas of Lima, were analyzed. Diagnosis of DEC was done with Multiplex real-time PCR using genes for each of the 6 DEC groups. Conventional PCR was performed for the detection of additional virulence genes. Results. Globally, the mean prevalence in diarrhea samples (n=4,243) was: enteroaggregative E. coli (EAEC) 9.9 percent, enteropathogenic E. coli (EPEC) 8.5 percent, enterotoxigenic E. coli (ETEC) 6.9 percent, diffusely adherent E. coli (DAEC) 4.8 percent, Shiga toxin-producing E. coli (STEC) 0.8 percent and enteroinvasive E. coli (EIEC) 0.6 percent. The relative frequency of each pathogen varies according to the age and the type of study. The main pathotypes in control samples (n=3,760) were EPEC (10.9 percent) and EAEC (10.4 percent). An important variability in the virulence genes frequency and molecular resistance mechanisms for each pathotype was found, without differences between diarrhea and control groups. Conclusions. DEC are a major cause of diarrhea in Peruvian children. These pathogens are highly heterogeneous. Additional studies are required to determine the prevalence in rural areas of Peru and in severe diarrhea cases.

Patrones de adherencia de cepas de Escherichia coli Difusamente adherente (DAEC) provenientes de niños con y sin diarrea / Adhesion patterns in diffusely adherent Escherichia coli (DAEC) strains isolated from children With and without diarrhea

Introducción. Las E. coli de adherencia difusa (DAEC) son el sexto grupo de E. coli diarrogénicas reconocidas. Su asociación con diarrea es controversial. No se conoce la variabilidad en los patrones de adherencia de cepas clínicas. Objetivos. Comparar los patrones de adherencia entre cepas aisladas de niños con y sin diarrea. Materiales y métodos. Se analizó 31 cepas DAEC, 25 de diarrea y 6 de niños asintomáticos (control) aislados de un estudio de cohorte de niños menores de 12 meses en el cono sur de Lima. Las DAEC fueron identificadas por PCR (gen daaD). Se evaluó el patrón y grado de adherencia en cultivos de células HEp-2; la polimerización de actina se evaluó por la prueba de coloración de fluorescencia de actina (FAS); y la motilidad se evaluó por métodos convencionales microbiológicos. Resultados. El patrón de adherencia difusa se encontró en el 88 por ciento de muestras de diarrea y en el 100 por ciento de muestras control. La cantidad de bacterias adheridas por célula fue significativamente menor en las muestras de diarrea (p<0,05). Sin embargo, la polimerización de actina fue mayor en las muestras de diarrea (60 por ciento frente a 17 por ciento). La prueba de motilidad fue positiva en el 60 por ciento de las cepas de diarrea y en el total de muestras control. Conclusiones. Nuestros hallazgos sugieren la existencia de diferencia en los patrones de adherencia, polimerización de actina y motilidad entre cepas de DAEC correspondientes a los grupos de diarrea y control. La significancia de estos resultados debe confirmarse con mayor número de cepas, así como la determinación de los genes de virulencia en las cepas.

Introduction. Diffusely adherent E. coli (DAEC) is the sixth recognized group of diarrheagenic E. coli. However, its association with diarrhea remains controversial. Variability in the adherence patterns of clinical strains is unknown. Objectives. To compare the adherence patterns between strains isolated from children with and without diarrhea. Materials and methods. A total of 31 DAEC strains were analyzed, 25 from children with diarrhea and 6 from asymptomatic (control) children, isolated from a cohort study of children under one year of age in the southern districts of Lima. DAEC were identified by PCR (daaD gene). The pattern and adherence score in HEp-2 cell culture were evaluated, Actin polimerization was determined by fluorescence actin staining (FAS) and motility was evaluated by conventional microbiology methods. Results. Diffuse adherence pattern was found in 88 percent of diarrhea samples and in the total of control strains. The number of bacteria adhered per cell was significantly lower in diarrhea samples (p<0.05). However, actin polymerization was greater in diarrhea samples (60 percent vs. 17 percent). Motility test was positive in 60 percent of the diarrhea samples and in all control samples. Conclusions. Our findings suggest a difference between adherence patterns, actin polymerization and motility between DAEC strains corresponding to diarrhea and control groups. The significance of these results must be confirmed with a bigger number of strains and determining the presence of virulence genes in the strains.